凝膠電泳是一種常用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，可鑒定、定量和純化核酸片段。我們常用的是瓊脂糖凝膠電泳，可以用來(lái)分離鑒定和純化DNA--pian段。
將樣品上樣到瓊脂糖膠的孔內(nèi)并放入電場(chǎng)，使帶負(fù)電荷的核酸向正極移動(dòng)。蛋白質(zhì)和核酸會(huì)根據(jù)pH不同帶有不同電荷，在電場(chǎng)中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據(jù)這個(gè)原理可將其分開(kāi)。較短的DNA--pian段遷移較快，而最長(zhǎng)的片段的遷移最為緩慢，從而實(shí)現(xiàn)基于DNA--pian段大小的分離。
每當(dāng)提取完質(zhì)粒之后在鑒定檢測(cè)DNA時(shí)，制備使用瓊脂糖凝膠的過(guò)程中應(yīng)該要多注意，DNA酶污染的儀器可能會(huì)使DNA降解，造成條帶信號(hào)弱、模糊甚至缺失的現(xiàn)象。為了得到更好的跑膠圖，我們應(yīng)該要考慮到以下幾個(gè)影響DNA分子遷移率的因素：
①凝膠濃度
對(duì)于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5~2%之間，低濃度的用來(lái)進(jìn)行大片段核酸的電泳，高濃度的用來(lái)進(jìn)行小片段分析，但是低濃度膠易碎，為了避免此現(xiàn)象，我們要小心操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失的現(xiàn)象。
②緩沖液
在沒(méi)有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠，電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動(dòng)，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化。
常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時(shí)使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能會(huì)使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。如圖所示：
③電壓和溫度
電泳時(shí)電場(chǎng)強(qiáng)度不應(yīng)該超過(guò)20V/cm，電泳溫度應(yīng)該低于30℃。低電壓時(shí)，線狀DNA---pian段遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量DNA--pian段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng)，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。若要使大于2kb的DNA---pian段的分辨率達(dá)到最大，所加電壓不得超過(guò)5v/cm，溫度應(yīng)該低于15℃。注意如果電泳時(shí)電壓和溫度過(guò)高，可能導(dǎo)致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導(dǎo)致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象。
④DNA樣品的純度和狀態(tài)
注意樣品中含鹽量太高和含雜質(zhì)蛋白均可以產(chǎn)生條帶模糊和條帶缺失的現(xiàn)象。乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的DNA樣品可能導(dǎo)致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對(duì)DNA樣品加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。
⑤DNA的上樣
正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。DNA上樣量大可能導(dǎo)致DNA帶型模糊對(duì)判斷其大小有影響，而太小的DNA上樣量則導(dǎo)致帶信號(hào)弱甚至缺失。
⑥Marker的選擇
DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對(duì)照DNA來(lái)估計(jì)DNA--pian段大小。Marker應(yīng)該選擇在目標(biāo)片段大小附近ladder較密的，這樣對(duì)目標(biāo)片段大小的估計(jì)才比較準(zhǔn)確。需要注意的是Marker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作標(biāo)準(zhǔn)。
⑦凝膠的染色和觀察（針對(duì)用EB染色的凝膠）
實(shí)驗(yàn)室常用的核酸染色劑是溴化乙錠(EB)，染色效果好，操作方便，但是穩(wěn)定性差，具有毒性。注意觀察凝膠時(shí)應(yīng)根據(jù)染料不同使用合適的光源和激發(fā)波長(zhǎng)，如果激發(fā)波長(zhǎng)不對(duì)，條帶則不易觀察，出現(xiàn)條帶模糊的現(xiàn)象。
最后我們來(lái)分析幾個(gè)凝膠圖：
DNA如果降解或者混有其他雜質(zhì)比如蛋白質(zhì)、RNA的話(huà),在電泳中我們是可以檢測(cè)到的。線性的單一DNA樣品一般是單條帶，質(zhì)粒的話(huà)可能會(huì)有2-3條帶，這和DNA分子的構(gòu)象有關(guān)，如圖一所示：
圖一
如果條帶變寬、變暗、或者變成彌散的DNA條帶,表示DNA非特異的降解，還有一種可能是太久沒(méi)有更換電泳緩沖液造成的。如圖二所示：
圖二
如果有蛋白質(zhì)污染,上樣孔可能發(fā)亮。如圖三所示：
圖三
如果跑膠時(shí)DNA上樣量過(guò)多導(dǎo)致條帶寬度大，無(wú)法準(zhǔn)確判斷其大小。
好，以上就是今天關(guān)于“影響核酸凝膠電泳結(jié)果的因素分析"的全部?jī)?nèi)容了，你看懂了么？
